Mario en zijn broer Luigi zijn terug voor deze tweede Super Mario Advance -titel: de eerste is een remake van Super Mario Bros. 2. De broers, samen met Princess Peach, zijn op vakantie in Dinosaur Island. Dan, wanneer ze het het minst verwachten, ontvoert Bowser Peach opnieuw en neemt haar mee naar zijn kasteel. Op weg om haar te redden, vinden de loodgieters Yoshi, die hen vertelt dat Bowser zijn vrienden ook in eieren heeft veranderd. Dus de Mario-broers moeten, met de hulp van Yoshi, de prinses en Yoshi’s vrienden redden.
Mario en Luigi kunnen door elk level rennen en springen. Ze kunnen ook power-ups verzamelen om nieuwe vaardigheden te krijgen. De Super Mushroom laat ze groeien en meer verdediging krijgen. De Fire Flower laat de broers vuurballen gooien om vijanden te verslaan. De Starman maakt ze onoverwinnelijk. De loodgieters kunnen de mogelijkheid krijgen om te vliegen met de Cape Feather.
Yoshi kan Mario en Luigi helpen als ze een ei vinden. De groene dinosaurus kan zijn tong gebruiken om vijanden op te eten of power-ups te pakken. Hij kan met zijn schoenen over bepaalde vijanden heen lopen. Yoshi kan verschillend gekleurde Koopa-schelpen eten om kortstondig meer vaardigheden te krijgen. De blauwe schelp geeft hem bijvoorbeeld vleugels, rode schelpen laten hem vuurballen spugen en de gele schelp laat hem op de grond stampen.
Deze update van de originele Super Nintendo-versie voegt de spraak van de personages toe (zoals te horen in Super Mario -games sinds Super Mario 64 ). Maximaal vier spelers kunnen het tegen elkaar opnemen in een gemoderniseerde versie van de klassieke Mario Bros. -game, die als extra bij de hoofdgame is inbegrepen.