Mario Kart 64 racet met acht bekende gezichten, waaronder Mario, Bowser en Yoshi, op vier steeds moeilijkere vierbaanscircuits. Brede bochten en zachte oevers kenmerken de Mushroom Cup-circuits. Je woon-werkverkeer wordt echter aanzienlijk zwaarder op de Flower Cup. De speler moet vrachtwagens ontwijken die op Toad’s Turnpike rommelen en stuiterende rotsblokken op de mistige Choco Mountain! Star Cup-circuits variëren van de ijzige oppervlakken van Sherbet Land tot de lavameren van Bowser’s Castle. De echte test van kartvaardigheden komt echter op de vier circuits in Special Cup. Race door de donkere grotten en groene heuvels van Donkey Kong’s Jungle Parkway, klamp je vast aan de steile kliffen van Yoshi Valley en haast je over de spookachtige Banshee Boardwalk voordat je het langste circuit in de game aanpakt: neonverlichte Rainbow Road.
De game biedt twee camerahoeken en drie motorgroottes: 50cc, 100cc en 150cc. Je kunt nog meer snelheid krijgen door de power slide-techniek onder de knie te krijgen of Super Star power-ups te pakken. Elke kart heeft een eigen rij-, acceleratie- en topsnelheidsvermogen. Lichte karts zoals die van Princess sturen soepel door krappe bochten, maar lopen het constante risico om platgereden te worden door zware karts, zoals die van Donkey Kong. Granaten die je afvuurt op rivaliserende racers, bananen waardoor ze slippen en bliksemschichten waardoor ze klein en heel langzaam worden, zijn slechts enkele van de unieke power-ups van het spel.