Het verhaal van Prison Break: The Conspiracy is gebaseerd op het eerste seizoen van de tv-serie Prison Break.
Het originele verhaal van de serie is gewijd aan de jonge ingenieur Michael Scofield en zijn uitgebreide plan om zijn broer Lincoln Burrows te redden, die ten onrechte werd beschuldigd van moord en nu wacht op zijn executie in de Fox River-gevangenis.
In het spel bestuurt de speler echter niet Michael, maar een personage dat niet aanwezig was in de tv-serie: Tom Paxton, een agent voor “The Company”, de belangrijkste schurkenorganisatie van Prison Break. Zijn missie is om de Fox River-gevangenis binnen te komen en aan het bedrijf te rapporteren over Michaels pogingen om met zijn broer te ontsnappen. Het originele verhaal dient daarom als achtergrond voor Paxtons ervaringen in de gevangenis.
Prison Break: The Conspiracy is in wezen een stealth-game met man-tegen-man-gevechten. Het grootste deel van het spel bestaat uit doelstellingen die Paxton door andere gevangenen zijn gegeven. Deze doelstellingen omvatten voor het grootste deel het sluipen langs bewakers, conciërges of vijandige gevangenen, en te allen tijde onopgemerkt blijven. Als de protagonist wordt gespot, keert de speler terug naar het vorige controlepunt en moet hij de rol van de sequentie opnieuw spelen. Als het vijandige personage een gevangene is, is het mogelijk om tegen hem te vechten.
Er zijn ook andere activiteiten waar de protagonist aan kan deelnemen als hij niet op een missie is, zoals gewichtheffen, tatoeages laten zetten en vechten met andere gevangenen voor geld en andere prijzen.