King K. Rool heeft Donkey Kongs bananenvoorraad gestolen en Donkey Kong heeft jouw hulp nodig om ze terug te krijgen. Op zoek naar K. Rool belemmert de Kremling-horde je voortgang. Kremlings, krokodilachtige wezens, omvatten Kritters (ze bezwijken door een simpele sprong op het hoofd), Krushas (ze zijn vrijwel onverwoestbaar) en anderen. Er zijn ook andere vijanden die je pad blokkeren, zoals bevers, slangen en gieren. Ze worden geleid door lafhartige bazen, waaronder Very Gnawty, Necky, Queen B. en Dumb Drum, en ze blokkeren allemaal de weg met hun eigen speciale mix van schurken.
Donkey Kong wordt vergezeld door Diddy Kong: deze twee primaten verschillen aanzienlijk. Donkey Kong is bijvoorbeeld over het algemeen sterker; hij kan de meeste vijanden met één sprong vernietigen en kan vaten recht boven zijn hoofd tillen om ze verder te gooien. Diddy is daarentegen sneller en niet zo sterk als Donkey; hij kan heel hard rennen en radslagen maken. Diddy draagt vaten voor zich uit, wat een schild vormt tegen frontale aanvallen.
Het spel is verdeeld in verschillende werelden, die verdeeld zijn in verschillende levels. Elk level bevat bonusgebieden, waar men bananen, medaillons en levens kan verzamelen. Aan het einde van elke wereld is er een baas, die meestal een grotere versie is van een kleine vijand.
De originele Super Nintendo-game werd later uitgebracht voor Nintendo’s handheld-systemen. De Game Boy Color-versie heeft een exclusief level (Necky Nutmare) en extra bonusspellen, Funky’s Fishing en vijf Crosshair Cranky-minigames. Er werden ook verzamelbare DK-stickerpakketten toegevoegd die verspreid lagen over de levels. Deze stickerpakketten konden worden afgedrukt met de Game Boy Printer. De game heeft ook twee extra moeilijkheidsgraden die beschikbaar worden na het uitspelen van de game. Als de game eenmaal is uitgespeeld, kan de speler DK-vaten uitschakelen en als de game een tweede keer is uitgespeeld, kan de speler checkpoint-vaten uitschakelen.
De Game Boy Advance-versie had ook extra bonusspellen. Het heeft ook een versie van Funky’s Fishing, maar in plaats van de crosshair-themaspellen is er nu Candy’s Dance Studio, dat zes dansspellen host. Er zijn ook de toevoegingen van een time attack-modus genaamd DK Attack, een moeilijkere moeilijkheidsgraad genaamd Hero Mode (kan alleen als Diddy Kong worden gespeeld en het spel biedt geen Donkey Kong-vaten en checkpoints meer in de levels), en het idee van het stickerboek uit de Gameboy Color-versie werd vervangen door het verzamelen van plakboekfoto’s.