Donkey Kong is “kongnapped” door de vervelende K. Rool en de Kremlings, en het is aan Diddy Kong en zijn vriendin Dixie Kong om hem te redden.
Alle bekende vijanden en behulpzame vrienden keren terug, samen met een aantal nieuwe personages, waaronder de wijze Wrinkly Kong die je een aantal belangrijke lessen in gameplay zal leren. Opnieuw ligt de nadruk op het verzamelen van bananen, terwijl elke honderd bananen één extra leven opleveren. Naast het verslaan van K. Rool en het redden van Donkey Kong, zijn er extra missies die voltooid kunnen worden. Verzamel genoeg K. Rool Kremkoins om de routes naar de Lost World te openen, terwijl elk level een verborgen Hero Coin heeft om te verzamelen.
De Game Boy Advance-versie bevat ook een bonusspelmodus met drie minigames (Expresso’s Racing, Funky’s Flights en Bag a Bug) plus een time attack-modus genaamd Diddy’s Dash (voltooi levels zo snel mogelijk als Diddy Kong). Deze versie van het spel bevat ook een extra baas (Kerozene) en twee extra verzamelobjecten (Golden Feathers die Expresso’s statistieken verhogen in het Expresso’s Racing bonusspel en foto’s die een plakboek vullen). Door de toevoeging van de bonusspellen en het plakboek zijn er ook 28 extra Hero Coins toegevoegd.