De prinses is ontvoerd door de kwaadaardige Bowser en het is aan Mario en broer Luigi om de dag te redden.
Het allereerste platformavontuur voor de Mario Brothers heeft de speler die niveau na niveau verkent, met Bowser om mee te kampen als het einde van de baas van het niveau. Power-ups omvatten de Super Mushroom, die Mario’s grootte en kracht, de vuurbloem vergroot, waardoor hij vuurballen op vijanden kan schieten, en de steeds belangrijker wordende sterman voor een korte uitbarsting van onoverwinnelijkheid.
Elk level bevat een bonussectie gevuld met munten plus een snelkoppeling door het niveau, veel slechte aankopen en obstakels om voorbij te komen, en een vlag op het einde van het niveau, waarin hoe hoger de speler het grijpt, hoe meer punten worden toegekend. Bepaalde niveaus omvatten ook warppunten, die de speler naar een hoger niveau tillen.