Leerling-ingenieur Link is klaar om naar Hyrule Castle te reizen en zijn ingenieurslicentie te halen – en Prinses Zelda zelf te ontmoeten! Tijdens de ceremonie stopt Zelda Link echter een briefje toe waarin hij hem waarschuwt de Chancellor niet te vertrouwen en haar te helpen de Spirit Tower te bereiken. De Spirit Tracks (mystieke spoorrails die het land bedekken) van het land zijn verdwenen en ze vermoedt dat de Chancellor de oorzaak is. Terwijl hij naar de Tower gaat, onderschept de Chancellor ze en bewijst dat Zelda’s vermoedens juist zijn – hij spreekt een magische spreuk op haar uit, waardoor haar lichaam van haar ziel wordt gescheiden! Link en Zelda moeten samenwerken om Zelda weer normaal te maken en Hyrule opnieuw te redden.
In The Legend of Zelda: Spirit Tracks neemt de speler de rol van Link aan. Net als in de vorige game, Phantom Hourglass, leiden spelers Link volledig met de stylus – waarmee ze hem verplaatsen, vijanden targeten en speciale wapens besturen. De speler wordt ook aangemoedigd om aantekeningen te maken op de in-game maps – en in bepaalde puzzels is het cruciaal om dat te doen. Link krijgt nieuwe tools in het spel naarmate hij vordert, waaronder een windmolen, die wordt gebruikt om puin, gifgas en vijanden weg te blazen, en de panfluit, die wordt gebruikt om speciale melodieën te activeren die nieuwe gebieden ontgrendelen, geheimen ontdekken en meer. In bepaalde dungeons besturen spelers zowel Link als Zelda, terwijl ze samenwerken. In haar geestvorm is Zelda in staat om enorme Phantom-pantsers te bezitten, die kunnen worden gebruikt om vlammen te blokkeren, Link te beschermen en hem door gevaarlijke gebieden te dragen.
Zoals de titel al suggereert, is de belangrijkste manier van transport een trein. Spelers tekenen hun route naar het volgende gebied op de map en laten de trein vervolgens zijn koers bepalen. Terwijl de trein rijdt, moeten ze uitkijken voor andere treinen, obstakels en dieren op de rails, en vijanden. Ze moeten ook de beste spoorroute in de gaten houden, die ze kunnen veranderen als ze een kruispunt naderen.